Introducción
La biorremediación es la eliminación, transformación o atenuación de xenobióticos mediante procesos biológicos llevados a cabo por organismos o los productos de estos (Shukla, Singh & Sharma, 2010; Adams, Fufeyin, Okoro & Ehinomen, 2015). Las técnicas de biorremediación pueden ser de dos tipos: la bioestimulación, donde se establecen las condiciones fisiológicas y de nutrición adecuadas, para inducir el crecimiento de los microorganismos nativos y la bioaumentación en la que se utilizan microorganismos específicos, cultivados previamente en presencia de contaminantes (Maheshwari et al., 2014).
Los microorganismos se caracterizan por ejercer una función importante en la degradación de xenobióticos, influir en los procesos físicos o químicos de la degradación y persistir a los compuestos recalcitrantes (Chakrabarty, 2017). Actualmente, las bacterias son las más estudiadas, debido a que cuentan con una extensa capacidad de adaptación (Biswas, 2015), son de crecimiento rápido y en general, más fáciles de cultivar en el laboratorio que otros microorganismos (Ortiz-Hernández, Sánchez-Salinas, Olvera-Velona & Folch-Mallol, 2011), como las siguientes: Flavobacterium sp., (Sethunathan & Yoshida, 1973), Sphingomomas sp., (Yao et al, 2015), Actinobacteria, Streptomyces sp., (Wang et al, 2017), Diferentes especies del género Bacillus (Ishag et al, 2017), Stenotrophomonas y Pseudomonas (Deng et al, 2015).
Los hongos, también presentan la capacidad de formar redes miceliales, además de usar el contaminante como sustrato de crecimiento y un sistema enzimático inespecífico, que los convierten en importantes herramientas biológicas para utilizar en la biorremediación (Harms, Schlosser & Wick, 2011). Como en Phanerochaete sordida (Mori et al., 2017) y los hongos ectomicorrícicos: Boletus edulis, Gomphidius viscidus, Laccaria bicolor, y Leccinum scabrum (Huang et al., 2007). El objetivo de este trabajo fue, a partir de suelos agrícolas mexicanos contaminados con agroquímicos, aislar e identificar microorganismos tolerantes a los plaguicidas, capacidad que los convierte en biodegradadores.
Materiales y métodos
Muestreo de suelo agrícola
Se obtuvieron muestras de los estados de Tamaulipas y Guanajuato, del primero en la localidad de la Estación Cuauhtémoc [22° 20’ y 22° 49’ N; 98° 21’y 97° 50’ O; entre 50 y 300 msnm] y en el municipio de Río Bravo [26° 05’ y 25° 23’ N; 98° 11’y 97° 51’ O; entre 50 y 500 msnm] y del segundo en los límites de Dolores Hidalgo [21° 21’ y 20° 51’ N; 100° 38’ y 101°13’O, entre 1,800 y 2, 800 msnm]. Las muestras se tomaron dentro de una parcela, en donde a partir de su centro y hacia el perímetro se eligieron al azar diez sitios en los que de cada uno, y a una profundidad de 10 cm, se extrajo 1 Kg de tierra, completando un total de 10 Kg que se secaron a temperatura ambiente durante 24 h, posteriormente se tamizaron en una malla del número 2 con una apertura de 20 mm, para obtener una muestra fina y homogénea. Las muestras se almacenaron en bolsas estériles a 4 °C.
Criterio de selección para la concentración Las concentraciones de 2,4 D y Malatión en la primera preselección son las mínimas reportadas para cada plaguicida en la literatura y en la segunda pre-selección se utilizaron las concentraciones máximas reportadas tanto para bacterias como hongos. (Tabla I)
Cultivo preselectivo de bacterias
La primer pre-selección se realizó en matraces de 250 mL, que contenían 100 mL de medio mínimo (MM), adicionado con 10 g de tierra seca tamizada, y como única fuente de carbono se agregó la concentración mínima del plaguicida; para inhibir el crecimiento fúngico se añadió 9.4 µl L-1 de carboxina [16 μM], incubándose durante 48 h a 37 °C y 170 rpm (Thermo Scientific, 435, MAXQ 480R HP). El control positivo consistió en un matraz sin plaguicida, con 1 g de glucosa como fuente de carbono y un control negativo sin glucosa. Transcurrido el periodo de incubación, se separó la fase acuosa del sedimento, filtrando el tratamiento con ayuda de un papel filtro de 10 x 10 cm y un embudo estéril, el sobrenadante se almacenó a 4°C hasta su uso.
En la segunda preselección se utilizaron tubos Falcón estériles de 50 mL, a los que se añadieron 20 mL de medio mínimo (MM), 1 mL del filtrado obtenido y las concentraciones máximas reportadas de los plaguicidas; con las mismas condiciones de incubación ya mencionadas. Al término del periodo de incubación se realizaron diluciones seriadas con agua estéril (10-1 a 10-4) de cada una de las concentraciones. Después se inocularon 500 μL (de cada dilución) en el centro de una caja de Petri de 100 x 15 mm con Agar y Medio Mínimo (adicionado con la concentración del plaguicida correspondiente, el inóculo se distribuyó en toda la superficie del agar con perlas de vidrio estériles y se incubó durante 24 h a 37°C, o hasta observar el crecimiento bacteriano (CO2 Incubator, Shel LAB). Después se aislaron las bacterias tomando una porción de la colonia con un asa bacteriológica estéril y se sembró mediante estriado cruzado en cajas de Petri de 100 x 15 con Agar Nutritivo (AN) (adicionado con 9.4 µl L-1 de carboxina) marca MCD LAB., incubándose durante 12 h a 37 °C. Las cajas se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
Cultivo preselectivo de hongos
El cultivo de hongos es el mismo que para las bacterias con las siguientes variables: el periodo de incubación fue de 72 h a 28 °C y 250 rpm, para la inhibición de las bacterias se adicionó 1 µL mL-1 de ampicilina [100 µg mL-1]. En la segunda preselección para la incubación de las colonias también se utilizaron cajas Petri (100 x 15 mm) en un período que puede variar hasta observar el crecimiento fúngico de 4 días a 28 °C. El aislamiento de los hongos se realizó con un palillo estéril tomando una porción del micelio que se colocó, por picadura, en el centro del Agar Papa Dextrosa (PDA) marca MCD LAB, contenido en una caja Petri de (100 x 15mm), para incubación durante 72 h a 28 °C.
Morfología de los microorganismos aislados
La identificación de las colonias bacterianas se realizó utilizando el manual Bergey’s of Systematic Bacteriology (Brenner et al, 2005), posteriormente en un portaobjetos se fijaron por calor y tiñeron utilizando la tinción de Gram para observarlas con un microscopio óptico tri ocular (Leica DM750, Leica ICC50 HD) utilizando el objetivo 100 X (objetivo de inmersión) empleando el Software Las EZ v. 3.0.0 Copyright© 2013 Leica Microsystems. Las colonias bacterianas se agruparon de acuerdo con sus diferencias fenotípicas y su morfología celular.
Para la identificación macro-morfológica fúngica se realizaron cultivos monospóricos; tomando en cuenta las características fenotípicas presentadas en el anverso (tamaño, color y forma) y reverso (pigmento) de la colonia. La micro-morfología (tipo de micelio y espora, modalidad de micelio, morfología de esporas, forma de vesícula y conidios) se identificó realizando la técnica de microcultivo. El montaje se visualizó en un microscopio óptico tri ocular usando los objetivos 40 X y 100 X.
Identificación molecular
Para la identificación de las cepas bacterianas, se realizó la extracción de DNAg mediante el protocolo comercial de Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, A1120), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se amplificó el gen 16S rDNA usando los oligonucleótidos universales dD1 (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’) y rP2 (5’- ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3´) diseñados por Weisburg (1991) y sintetizados por Biosynthesis (Lewisville, Tx). La reacción de amplificación contenía 12.5 µl de PCR PCRGoTaq® Master Mix 2 X (Promega ™), 1 µL de cada oligonucleótido (5 µM) y 1 μL de DNAg (50 ng) en un volumen final de 25 µL. Las condiciones de PCR usadas fueron un alineamiento a 94 °C/5 min; seguido de 35 ciclos de 94 °C/85 s, 58 °C/90 s, 72 °C/60 s; una extensión final a 72 °C/7 min. Después del gel de electroforesis, el producto de PCR fue purificado con ExoSAP-IT Clean up (Affly metrix, Inc) y cuantificado. Posteriormente fue enviado a Eurofins Genomics (EUA) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Las secuencias obtenidas fueron analizadas en el GenBank usando la base de datos BLAST.
Para la extracción de DNAg fúngico, se utilizó el método de cloroformo:octanol (24:1) de Reader & Broda (1985). Para ello se partió de 1 mL de cultivo de 48 h de crecimiento, al finalizar el DNA obtenido se cuantificó por Nano Drop, después, se amplificó la región ITS, utilizado los oligonucleótidos universales ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC - 27 3’) (White, Bruns, Lee & Taylor, 1990) sintetizados por Biosynthesis (Lewisville, Tx). La reacción de amplificación fue la misma que en el protocolo anterior. Las condiciones de PCR usadas fueron un alineamiento a 94 °C/5 min; 35 ciclos de 94 °C/30 s, 58 °C/30 s, 72 °C/60 s; una extensión final a 72 °C/7 min. Después del gel de electroforesis el producto fue purificado, secuenciado y analizado de acuerdo al protocolo anterior.
Pruebas de tolerancia en bacterias
En tubos de fondo plano (2.3 x 9.5 cm), se añadieron 15 mL de caldo nutritivo y se adicionaron las concentraciones de los plaguicidas y el inóculo (1x108 células mL-1); se incubó durante 24 h a 37 ° y 170 rpm. Las concentraciones utilizadas para el herbicida 2,4-D fueron de 1.0; 1.25; 1.50; 1.75; 2.0; 2.5; 3.0 y 3.5 g L-1. Para el insecticida malatión se utilizaron concentraciones a partir de 0.5; 0.10; 0.15; 0.20; 0.25; 0.50; 1.0; 1.25; 1.50 y 2.0 g L-1. La tolerancia se midió con base en la concentración celular (crecimiento microbiológico), el cual se determinó por las variantes de densidad óptica (DO), la lectura se analizó en un espectrofotómetro (Cintra 10e, UVVisible Spectrometer, GBC), utilizando el Software Cintral v 2.4 a una longitud de onda de 625 nm. El control negativo se efectuó en un medio enriquecido sin inóculo ni plaguicida, para el control positivo se utilizó el mismo medio inoculado con el microorganismo, sin plaguicida. Los intervalos de medición establecidos incluían la medición inicial (0 h) y a las 24 h posteriores a la inoculación todos los tratamientos se efectuaron por triplicado.
Pruebas de tolerancia en hongos
Estas pruebas, se ejecutaron bajo el mismo procedimiento que en las pruebas de tolerancia bacterianas, modificando el medio a caldo papa dextrosa y el periodo de incubación de 72 h a 28 °C, 250 rpm. Las concentraciones para el herbicida 2,4-D se establecieron dentro de un intervalo de 0.03; 0.06; 0.12; 0.25; 0.50; 1.0 y 2.5 g L-1 y para el insecticida malatión se realizaron concentraciones de 0.01; 0.03; 0.06; 0.12; 0.25; 0.50; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 2.7 y 3.0 g L-1. Los intervalos de medición se establecieron a las 0, 24, 48 y 72 h posteriores a la inoculación.
Análisis estadístico
Para determinar la tolerancia de los microorganismos a los Los microorganismos que crecieron en las concentraciones más altas de los plaguicidas, evaluados, 2,4-D y malatión, se infirieron como tolerantes. Las bacterias Acinetobacter lactucae, Pseudomonas aeruginosa y Stenotrophomonas pavanii mostraron la mayor tolerancia al herbicida 2,4-D a una concentración >2.0 g L-1 y >1.0 g L-1 al insecticida malatión, con excepción de la bacteria A. lactucae que, con plaguicidas se utilizó el programa estadístico IBM SPSS Statistics versión 22 utilizando el análisis de regresión, ejecutando el modelo Probit con prueba de significancia estadística P > 0.05.
Resultados
Se aislaron 68 bacterias y 6 hongos de la localidad Estación Cuauhtémoc, mientras que en la de Río Bravo fueron 90 bacterias y 12 hongos, por último del estado de Guanajuato se aislaron 120 bacterias y 3 hongos. Para la identificación molecular de las 278 bacterias se agruparon según su similitud morfológica y de esos grupos se escogieron 18 aislados representativos. En lo que concierne a los 21 hongos se seleccionaron 16 aislados representativos (Tabla II).
Tabla II
Selección de aislados bacterianos y fúngicos.
En el análisis molecular de los aislados de bacterias se identificaron: Pseudomonas plecoglossicida, Acinetobacter lactucae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter pittii y Stenotrophomonas pavanii (Tabla III).
Tabla III
Análisis molecular de los aislados bacterianos.
Para el caso de los hongos se identificaron los géneros Penicillium, Talaromyces, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium y Rasamsonia. (Tabla IV).
Tabla IV
Análisis molecular de los aislados fúngicos.
Los microorganismos que crecieron en las concentraciones más altas de los plaguicidas, evaluados, 2,4-D y malatión, se infirieron como tolerantes. Las bacterias Acinetobacter lactucae, Pseudomonas aeruginosa y Stenotrophomonas pavanii mostraron la mayor tolerancia al herbicida 2,4-D a una concentración >2.0 g L-1 y >1.0 g L-1 al insecticida malatión, con excepción de la bacteria A. lactucae que, coneste último plaguicida fue ligeramente menor en comparación con las concentraciones toleradas por Acinetobacter pittii (Tabla V).
Tabla V
Tolerancia en bacterias.
De acuerdo con el análisis estadístico, la mayor tolerancia en los hongos se <observó en Fusarium sp., que creció a una concentración > 0.9 g L-1 con el herbicida 2,4-D y > 2.0 g L-1 con el insecticida malatión, para este último compuesto T. variabilis toleró >3.0 g L-1 (Tabla VI).
Discusión
Las técnicas de biorremediación son importantes para desintoxicar sitios contaminados por xenobióticos recalcitrantes, como algunos agroquímicos. En este trabajo, los plaguicidas 2,4-D y malatión, fueron seleccionados por su amplia aplicación en los suelos de las regiones agrícolas muestreadas, además, son considerados tóxicos para el ser humano. Asimismo, en los microorganismos identificados se evaluó la tolerancia a esos plaguicidas. La bacteria Pseudomonas aeruginosa se eligió como tolerante, ya que mostró crecimiento a las concentraciones más altas evaluadas en este estudio, que fueron de 2.9 y 1.3 g L-1 de 2,4-D y malatión, respectivamente. Shafiani & Malik (2003), aislaron e identificaron al género Pseudomonas a partir de suelo agrícola, la bacteria se consideró como tolerante al plaguicida malatión a una concentración de 1,600 µg mL-1. Estudios realizados por Abo-Amer (2007), reportaron que P. aeruginosa presentó la capacidad de degradar 42.5 mg L-1 del insecticida malatión en un medio adicionado con peptona y extracto de levadura, el compuesto actúa como fuente secundaria de carbono, así como Saafan, Azmy, Amin, Ahmed & Essam (2016), registraron hallazgos similares con esta bacteria, la cual mostró el potencial de degradar hasta el 89% del malatión a partir de 100 mg L-1 adicionado con extracto de levadura y glucosa con los que visualizaron un aumento en la biomasa microbiana.
Por otra parte, la bacteria Stenotrophomonas pavanii creció a una concentración de 2.5 g L-1 del herbicida 2,4-D y 1.2 g L-1 del insecticida malatión, por lo que se seleccionó como tolerante. Sin embargo, S. pavanii no ha sido reportada en la tolerancia o degradación a los plaguicidas evaluados en este estudio. No obstante, Feng et al., (2017), reportaron a esta especie con la capacidad de degradar el insecticida organofosforado clorpirifos, utilizado como única fuente de carbono, la bacteria degradó el 90% del compuesto a partir de una concentración de 5 mg L-1. Además, algunos autores han registrado a especies del género Stenotrophomonas con la capacidad de degradar plaguicidas como el DDT, clorpirifos, fenvalerato, paratión, paraoxón, diazinón y foxim (Chen, Yang, Hu & Liu, 2011; Dubey & Fulekar, 2012; Deng et al, 2015; Barragan-Huerta et al, 2007).
La bacteria Acinetobacter lactucae, igualmente se seleccionó como tolerante debido a que creció a una concentración de 2.0 y 1.0, g L-1 del 2,4-D y malatión, respectivamente. Cabe mencionar que esa bacteria no ha sido estudiada en la degradación de los plaguicidas 2,4-D y malatión. Sin embargo, el género Acinetobacter ha sido reportado con la capacidad de degradar al plaguicida atrazina en medio mínimo, utilizado como la única fuente de carbono (Mirgain, Green & Monteil, 1993; Singh, Suri & Cameotra, 2004).
Por otra parte, en el hongo Cladosporium sp., no se logró medir la tolerancia mediante métodos turbidimétricos, debido al tipo de desarrollo que presentó, por lo que, es viable realizar la evaluación utilizando una metodología diferente como lo es la medición del crecimiento radial de la colonia (Arshad & Aishatul, 2015). El hongo Fusarium sp., se eligió como tolerante por presentar un crecimiento en concentraciones de 0.9 y 2.0 g L-1 del 2,4-D y malatión, respectivamente. Peter, Gajendiran, Mani, Nagaraj & Abraham (2015), registraron a la especie Fusarium oxysporum con la capacidad de degradar completamente al plaguicida malatión a una concentración de 400 mg L-1, este fue adicionado como única fuente de carbono en medio mínimo. Asimismo, este género se ha registrado con la capacidad de degradar otro tipo de compuestos como el poli succinato de butileno (PBS) (Mao, Liu, Gao, Su & Wang, 2015) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) (Potin, Rafin & Veignie, 2004; Wei et al, 2017). El hongo Talaromyces variabilis se seleccionó como tolerante únicamente al plaguicida malatión, porque creció a una concentración de 3.0 g L-1. Sin embargo, esta especie no ha sido reportada en la tolerancia o degradación de los plaguicidas evaluados en el presente trabajo. El género Talaromyces se ha caracterizado por incluir especies resistentes al calor (Yamashita, Nakagawa, Sakaguchi, Arima & Kikoku, 2018) de procesos industriales como la pasteurización, que impacta significativamente a diversos tipos de alimentos (Panek & Frąc, 2018).
Las bacterias Acinetobacter pitii, Atlantibacter hermanii y Pseudomonas plecoglossicida presentaron un crecimiento < 2.0 g L-1 con el herbicida 2,4-D e igual o < 1.0 g L-1 con el insecticida malatión, por lo que no se consideraron como tolerantes ni los hongos Aspergillus sp., Penicillium citrinum y Rasamsonia sp., debido a que mostraron un crecimiento a una concentración < 0.4 g L-1 en ambos plaguicidas. De los microorganismos mencionados Aspergillus sp., se ha utilizado en evaluaciones de degradación de los plaguicidas arbendazim, captan, mancozeb, metalaxil, tiram y carbofuran (Arshad & Aishatul, 2015). En el presente trabajo, las bacterias seleccionadas como tolerantes crecieron en concentraciones más altas del plaguicida 2,4-D (2.978 g L-1) en comparación a las evaluadas en los hongos (0.9 g L-1). Lo anterior podría suceder debido a que las bacterias usan al plaguicida como fuente de nutrientes y por ello logran tolerar concentraciones más altas (Mohiddin & Khan, 2013), en contraste con los hongos, en los que el plaguicida o sus metabolitos podrían permanecer en la biomasa sin presentar transformación (Botero, Mougin, Peñuela & Barriuso, 2017). La tolerancia a los plaguicidas se relaciona principalmente a la diversidad genética que codifica a enzimas especializadas en la degradación, esto se ve influenciado por los compuestos (Mousawi, 2005; Drouin, Sellami, Prevost, Fortin & Antoun, 2010), ya que un plaguicida induce a la formación de nuevas vías metabólicas en los microorganismos (Ahemad & Khan, 2011).
Además, hay autores que reportan especies bacterianas con la capacidad de degradar al herbicida 2,4-D en las que se incluyen a Flavobacterium sp. (Chaudhry & Huang, 1988), Achromobacter sp. (Xia et al., 2017), F. peregrinum, Arthrobacter sp. (Motosugi & Soda, 1983), Brevundimonas sp. (Smejkal, Seymour, Burton & Lappin-Scott, 2003) y especies fúngicas como Phanerochaete chrysosporium (Donnelly, Entry & Crawford, 1993; Yadav & Reddy, 1993), Paxillus involutus y Suillus variegatus (Meharg, Cairney & Maguire, 1997), Umbelopsis isabellina (Nykiel-Szymańska, Stolarek & Bernat, 2018). Por otro lado, las estrategias de biorremediación en México se han realizado con hongos del género Trichoderma, microorganismos nativos o consorcios para la degradación de plaguicidas como el DDT y sus metabolitos, el insecticida paratión, los herbicidas atrazina y 2,4-D. Lo anterior, se ha realizado en suelos bajo condiciones de laboratorio (Ortiz-Hernández, Monterrosas-Brisson, YanezOcampo & Sánchez-Salinas, 2001; Robles-González et al., 2006; Islas- Pelcastre et al., 2013; Ortiz, Velasco, Le Borgne & Revah, 2013). Además, se han llevado a cabo estudios de biodegradación utilizando consorcios bacterianos, en los que se incluyen a las bacterias Stenotrophomonas malthophilia, Proteus vulgaris, Vibrio metschinkouii, Serratia ficaria, Serratia sp. y Yersinia enterocolitica; estos fueron evaluados en la degradación de los insecticidas tetraclorvinfos y paratión (Ortiz-Hernández et al., 2001; Ortiz-Hernández & Sánchez-Salinas, 2010). A pesar de que en México no se han registrado estudios de biorremediación con la bacteria Acinetobacter lactucae, en el presente trabajo se evidenció su potencial capacidad para tolerar el insecticida malatión y por ésto sea posible su utilización en las técnicas de biorremediación de suelos.
Conclusiones
Las cepas con mas tolerancia a 2,4-D y malatión fueron Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas pavanii, Acinetobacter lactucae, Fusarium sp. y Talaromyces variabilis. Para el caso de S. pavanii, A. Lactucae y T. variabilis no existen reportes de tolerancia a los plaguicidas mencionados, sin embargo, en este trabajo se demuestra por primera vez que pueden ser utilizados en técnicas de biorremediación de suelos.
